?抗污染抗生素

細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何避免細(xì)胞污染？

1 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)確保處于無菌環(huán)境，并使用恰當(dāng)?shù)臏缇夹g(shù)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)過程中所使用的培養(yǎng)基或添加的培養(yǎng)物均要確保無菌無污染。

3 定期使用顯微鏡或檢測試劑盒監(jiān)測細(xì)胞培養(yǎng)基，以確保無微生物污染。

4 使用抗污染抗生素。在原代細(xì)胞培養(yǎng)或克隆過程中微生物污染是難以發(fā)現(xiàn)的，Invivogen公司為此設(shè)計(jì)了具有預(yù)防功能的防污染試劑。Invivogen公司可提供的抗污染抗生素有Plasmocin™ prophylactic，Normocin™， Primocin™ 及Fungin™。

如何鑒別細(xì)胞培養(yǎng)過程中被哪種微生物污染？

如果細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在細(xì)菌和/或真菌污染，可以使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鑒別。因?yàn)樗鼈兊纳L速度很快，可以使細(xì)胞培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁或菌斑，一般48小時(shí)后即可用肉眼檢測。隨后可使用檢測試劑盒對(duì)這些微生物種類進(jìn)行鑒定。然而，支原體污染不能直接用肉眼觀察，也不能通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行鑒別，只能通過不一樣的分析方法（如支原體檢測試劑盒）進(jìn)行檢測。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中支原體污染很容易被忽視。Invivogen提供的PlasmoTest™支原體污染檢測試劑盒結(jié)果可靠，分析準(zhǔn)確，尤其是可以排除假陽性或不確定的結(jié)果。

針對(duì)不同微生物的污染，應(yīng)如何選擇Invivogen的抗污染抗生素？

在凍存細(xì)胞之前的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，可以添加抗污染抗生素嗎？

可以的，在凍存細(xì)胞之前可以添加Plasmocin™ prophylactic（預(yù)防支原體污染試劑）或廣譜抗生素Normocin™。但是，在這之前需使用光學(xué)顯微鏡鑒定細(xì)胞是否被細(xì)菌或真菌污染，或使用PlasmoTest™支原體檢測試劑盒檢測是否存在支原體污染。

Invivogen是否可以提供一種可以同時(shí)抵抗細(xì)菌、真菌、支原體污染的抗生素嗎？

Normocin™和Primocin™這兩款抗生素是廣譜性的，可同時(shí)抵御細(xì)菌、真菌、支原體的污染。兩者的區(qū)別是Primocin™推薦用于原代細(xì)胞培養(yǎng)中預(yù)防微生物的污染，而Normocin™則推薦用于細(xì)胞系培養(yǎng)。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可以同時(shí)使用Invivogen的抗污染抗生素及基因篩選抗生素嗎？抗污染抗生素會(huì)影響基因篩選抗生素的作用效果嗎？

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可同時(shí)使用Invivogen的抗污染抗生素及基因篩選抗生素，抗污染抗生素的使用不會(huì)干擾常用的基因篩選抗生素的作用效果，例如G418, Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B和 Zeocin™。

?細(xì)菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)如何鑒別細(xì)菌污染？

由于細(xì)菌比真核細(xì)胞小很多，因此在細(xì)菌污染的早期階段通常被認(rèn)為是細(xì)胞碎片。這個(gè)時(shí)候應(yīng)使用放大倍數(shù)為100×-400×的光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)基的狀態(tài)。如果觀察到黑色斑點(diǎn)、桿狀物或螺旋狀物，那培養(yǎng)基應(yīng)該是被細(xì)菌污染了。由于細(xì)菌生長快速，在污染后的48小時(shí)內(nèi)便可引起培養(yǎng)基的變化，使培養(yǎng)基變渾濁。若培養(yǎng)基中含有酚紅，由于細(xì)菌的新陳代謝使培養(yǎng)基的pH下降，從而導(dǎo)致培養(yǎng)基的顏色迅速變?yōu)辄S色。因此在細(xì)菌污染48小時(shí)之后，便可用肉眼直接觀察。微生物污染后的細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)該棄去，但如果沒有其他替代的培養(yǎng)基可用，則可使用Invivogen的Plasmocin™ Treatment, Normocure™或者 Plasmocure™污染物清除試劑。

當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中不確定具體是哪種細(xì)菌污染細(xì)胞時(shí)，應(yīng)該選擇哪種抗污染抗生素？

當(dāng)不確定細(xì)胞是被哪種細(xì)菌污染時(shí)，推薦使用對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有效，具有光譜抗性的Normocure™。目前的研究結(jié)果表明，Normocure™可有效預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染，例如葡萄球菌、無色桿菌。

?真菌污染

細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)如何鑒別真菌污染？

由于真菌菌絲可用肉眼或光學(xué)顯微鏡觀察，因此真菌污染細(xì)胞培養(yǎng)基之后可直接通過肉眼或者光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測。酵母（30-10 um）是形態(tài)結(jié)構(gòu)最小的真菌，在光學(xué)顯微鏡下便可被觀察到。另外，真菌的生長繁殖會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基中pH值增加，從而使含酚紅的培養(yǎng)基呈粉色。在大量真菌污染物存在的情況下，菌落可能形成霉菌，漂浮在培養(yǎng)基表面。此時(shí)應(yīng)立即丟棄培養(yǎng)基，以防孢子傳播。

細(xì)胞培養(yǎng)過程中為預(yù)防或清除真菌污染，Fungin™可以與青霉素、鏈霉素（Pen-Strep）同時(shí)使用嗎？

可以的，Fungin™可以與一般的抗生素如青霉素、鏈霉素一起使用。

Fungin™可以在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacConkey Agar）和血平板培養(yǎng)基中使用嗎？ 

可以的，Fungin™可以在其他培養(yǎng)基，如麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MacConkey Agar）和血平板培養(yǎng)基中使用。

已經(jīng)使用Fungin™處理了7天，但不確定真菌污染是否已全部被清除，對(duì)于這個(gè)問題有什么建議嗎？

Invivogen建議將培養(yǎng)基分成兩份，一份繼續(xù)使用Fungin™繼續(xù)處理3-4天，另外一份中加入無Fungin™或青霉素-鏈霉素的新鮮培養(yǎng)基，之后取1 mL至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于20-25℃ 3-5天。此方法可以幫您確認(rèn)培養(yǎng)基中的真菌污染物是否已全部被清除。

推薦使用什么濃度的Fungin™處理細(xì)胞？

說明書中推薦使用50 ug/mL的Fungin™處理細(xì)胞，但Invivogen建議同時(shí)做75 ug/mL的平行處理組，以估計(jì)去除真菌污染的最佳使用劑量。處理時(shí)間應(yīng)持續(xù)5-10天。

?支原體污染

如何使用Invivogen的支原體檢測試劑盒Plasmo TestTM檢測支原體？

PlasmoTest™支原體檢測試劑盒是一種基于細(xì)胞的比色分析方法，利用Toll樣受體II可以識(shí)別支原體成分（脂肽）的能力，誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致NF-κB和其他轉(zhuǎn)錄因子的激活。在支原體存在的情況下，HEK-Blue™-2細(xì)胞表面表達(dá)的TLR2會(huì)激活這些轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)分泌sAP（分泌性堿性磷酸酶）報(bào)告蛋白，可在16 - 24小時(shí)內(nèi)被HEK-Blue™檢測培養(yǎng)基檢測到。

Invivogen的支原體檢測試劑盒Plasmo TestTM只能檢測活的支原體嗎？

PlasmoTest™支原體檢測試劑盒是通過檢測支原體脂蛋白來判斷是否有支原體存在的，因此其既可以檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的活的支原體，也可以檢測死的支原體。

另外，Invivogen的PlasmoTest™支原體檢測試劑盒不僅可以檢測支原體的脂蛋白，也可以檢測細(xì)菌的脂蛋白。但是由于細(xì)菌污染可直接通過觀察細(xì)胞培養(yǎng)基的狀態(tài)進(jìn)行鑒定，因此，當(dāng)PlasmoTest™檢測試劑盒結(jié)果呈現(xiàn)陽性，且細(xì)胞培養(yǎng)基無渾濁、顏色無變化時(shí)，可以斷定培養(yǎng)基受到了支原體污染。

Invivogen的支原體檢測試劑盒Plasmo TestTM與其他支原體檢測試劑盒相比，有什么優(yōu)勢(shì)嗎？

PlasmoTestTM是第一個(gè)基于細(xì)胞分析原理檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中支原體污染的試劑盒，操作者只需具有基本的細(xì)胞培養(yǎng)的知識(shí)即可進(jìn)行操作。試劑盒在過夜孵育之后，一小時(shí)之內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果。以往常用的支原體檢測方法是PCR，但這種檢測方法具有明顯的缺陷，例如假陰性結(jié)果且能夠檢測的支原體種類受引物限制，無法對(duì)全部支原體進(jìn)行檢測。最重要的是，Plasmo TestTM檢測結(jié)果呈陽性時(shí)，即表明細(xì)胞培養(yǎng)基中存在支原體污染物，因此不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用哪種試劑來預(yù)防支原體污染？使用那種試劑清除已污染的支原體？

● Plasmocin™ prophylactic（支原體預(yù)防試劑）是專門用于預(yù)防支原體污染的，它含有兩種有效的殺菌成分，作用于蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制。

● Plasmocin™ treatment（支原體清除試劑），可在2 - 3周內(nèi)快速有效地消除支原體污染。如果2-3周之后使用Plasmocin™支原體清除試劑之后無法有效清除支原體污染，或支原體對(duì)Plasmocin™產(chǎn)生了耐藥性，可使用● Plasmocure™。Plasmocin™ treatment和Plasmocure™均是由兩種不同抗生素混合而成，通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用，可使支原體在2 - 3周內(nèi)全部清除。

在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可以直接使用Plasmocure™代替Plasmocin™ treatment清除已污染的支原體嗎？

Plasmocin™ treatment和 Plasmocure™均是混合抗生素，用于清除已污染支原體。然而，Invivogen推薦只有在支原體對(duì)Plasmocin™ treatment產(chǎn)生抗性的情況下才可使用Plasmocure™。

如果支原體對(duì)Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均已產(chǎn)生抗性，應(yīng)該怎么辦呢？

如果使用Plasmocure™、Plasmocin™ treatment均無法有效清除細(xì)胞中的支原體污染物，則表明樣本中的支原體污染非常嚴(yán)重。這種情況下好的辦法是在下一次傳代時(shí)盡可能稀釋您的細(xì)胞，以此來稀釋細(xì)胞中的支原體污染物。之后使用不同濃度（確保對(duì)細(xì)胞不會(huì)有太大毒性的濃度）的Plasmocure™再次處理細(xì)胞2周，例如使用工作濃度為50 ug/mL和100 ug/mL的Plasmocure™處理細(xì)胞。處理2周之后，將細(xì)胞分成兩份，一份使用Plasmocure™繼續(xù)處理一周，另一份不添加任何抗生素，3天后使用PlasmoTest™支原體檢測試劑盒檢測污染情況，以避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。如果您的細(xì)胞仍存在支原體污染，請(qǐng)重復(fù)以上步驟。

以上的操作步驟可有效清除90%的支原體污染，若您樣本中的支原體污染物未得到有效清除，請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系我們。